自2013年歐盟全面禁止化妝品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以來(lái)，體外重建皮膚模型已廣泛應(yīng)用于藥物和化妝品功效研究及毒理評(píng)價(jià)。然而，現(xiàn)有的體外皮膚模型在模擬皮膚功能方面，尤其在血管化重建方面，仍存在顯著不足，這導(dǎo)致難以實(shí)現(xiàn)組織區(qū)域的有效灌注。

摩方精密圣地亞哥研究院團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種全新的三維可灌注血管化皮膚芯片，采用了摩方精密的面投影微立體光刻（PμSL）技術(shù)，精確構(gòu)建仿生微毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。該皮膚芯片在營(yíng)養(yǎng)供給、增強(qiáng)屏障功能和維持組織活性方面表現(xiàn)優(yōu)異，與傳統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞自組裝或犧牲材料方法相比，該模型簡(jiǎn)化了操作流程并提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。通過(guò)石蠟切片、蘇木精-伊紅（H&E）染色和免疫熒光標(biāo)記方法，驗(yàn)證了芯片中的真皮層和表皮層的完整結(jié)構(gòu)。

這一研究成果以“Full-Thickness Perfused Skin-on-a-Chip with In Vivo-Like Drug Response for Drug and Cosmetics Testing "為題，發(fā)表在《Bioengineering》上。摩方精密圣地亞哥研究院的Stephen Rhee為論文第一作者，孫冰潔博士為通訊作者。

此外，該芯片支持高通量測(cè)試，其定制化夾具支持在多孔板中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)芯片的灌注實(shí)驗(yàn)。通過(guò)使用TNF-α誘導(dǎo)炎癥及地塞米松的抗炎治療，摩方研究團(tuán)隊(duì)將該芯片與傳統(tǒng)2D培養(yǎng)和人類(lèi)皮膚活檢樣本進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明，皮膚芯片與人類(lèi)皮膚的藥物反應(yīng)趨勢(shì)一致，且在長(zhǎng)期培養(yǎng)中表現(xiàn)出更低的細(xì)胞毒性。

這一灌注皮膚芯片為藥物和化妝品篩選提供了一個(gè)高度仿生的體外模型，顯著提高了實(shí)驗(yàn)的生理相關(guān)性。

01

精密3D打印與微流控設(shè)計(jì)

還原真實(shí)血管化全層皮膚環(huán)境

通過(guò)PμSL 3D打印技術(shù)（microArch® S230，精度：2微米），摩方研究團(tuán)隊(duì)成功地在芯片中構(gòu)建了仿生微毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，每個(gè)中空的微通道表面均勻分布有7微米的開(kāi)放微孔，微通道內(nèi)可以灌輸細(xì)胞培養(yǎng)基，使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣能夠從通道內(nèi)均勻擴(kuò)散至管道外的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域。同時(shí)，灌輸系統(tǒng)可有效排出代謝廢物，從而確保細(xì)胞的健康生長(zhǎng)和組織的長(zhǎng)期活性。微通道貫穿整個(gè)皮膚組織，保證了培養(yǎng)基在組織內(nèi)的均勻供給。

為了提高皮膚芯片的功能性和操作便捷性，摩方研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了定制化芯片夾具，確保皮膚芯片能夠精確放置，并與標(biāo)準(zhǔn)的6孔板兼容。夾具蓋的設(shè)計(jì)可提供穩(wěn)定的氣液界面，這對(duì)于皮膚模型的全面仿生功能化至關(guān)重要。（圖1展示了皮膚芯片與夾具的設(shè)計(jì)細(xì)節(jié)，圖2展示了灌注系統(tǒng)的設(shè)置和操作流程。）

圖1. 皮膚芯片與夾具示意圖。(a，b) 皮膚芯片的俯視圖與正視圖，顯示微通道的布局及內(nèi)部結(jié)構(gòu)；(c) 微孔的掃描電鏡（SEM）圖像，比例尺：200微米；(d) 放大后的SEM圖像，展示單個(gè)微孔，比例尺：20微米；(e) 皮膚芯片與夾具組裝前的圖像；(f) 皮膚芯片裝入夾具后的側(cè)視圖；(g) 六個(gè)皮膚芯片及夾具放置于六孔板中的圖像。

圖2. 皮膚芯片灌注系統(tǒng)的設(shè)置與操作流程，通過(guò)簡(jiǎn)單的三步流程即可輕松實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定灌注。(1) 將皮膚芯片放入夾具中；(2) 將夾具插入六孔板并固定蓋子；(3) 連接灌注系統(tǒng)的入口和出口端口并啟動(dòng)灌注。灌注系統(tǒng)通過(guò)管道連接入口與出口，入口管道連接裝有培養(yǎng)基的注射器，并與雙向注射泵相連；出口管道連接空注射器以收集廢液，同樣連接到雙向注射泵。

02

灌注監(jiān)測(cè)流體情況

營(yíng)養(yǎng)供給和小分子吸收測(cè)試

研究團(tuán)隊(duì)使用熒光小分子溶液進(jìn)行灌注測(cè)試，監(jiān)測(cè)流體在芯片中的流動(dòng)與擴(kuò)散情況。熒光溶液以10微升/分鐘的速度注入微通道，熒光分子均勻擴(kuò)散并充滿芯片，整塊芯片中的熒光強(qiáng)度隨之而逐漸增加（圖3a-b）。雖然PDMS常用于傳統(tǒng)器官芯片系統(tǒng)，但其對(duì)小分子的吸收會(huì)影響藥物測(cè)試的準(zhǔn)確性。因此，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)芯片使用的BIO材料進(jìn)行了小分子藥物的吸收測(cè)試，將五種FDA批準(zhǔn)的小分子藥物與BIO材料孵育24小時(shí)并和對(duì)照組對(duì)比，通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析。結(jié)果表明，BIO材料中的藥物濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異，證明該材料不會(huì)吸收小分子（圖3c）。

圖3. 皮膚芯片系統(tǒng)中小分子擴(kuò)散與吸收的驗(yàn)證(a) 灌注后微通道中熒光小分子擴(kuò)散到芯片中的時(shí)間序列圖像，比例尺：1毫米；(b) 灌注后芯片內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化圖；(c) 孵育BIO材料24小時(shí)后藥物溶液中小分子藥物的濃度。

03

仿真人類(lèi)皮膚組織的構(gòu)建

灌注系統(tǒng)應(yīng)用及形態(tài)分析

為了模擬體內(nèi)皮膚環(huán)境，研究團(tuán)隊(duì)在皮膚芯片上成功重建了表皮層和真皮層。真皮層由成纖維細(xì)胞與I型膠原蛋白水凝膠構(gòu)成，表皮層則由種植在真皮層上的角質(zhì)形成細(xì)胞組成。真皮層被種植在微通道周?chē)?，確保灌注系統(tǒng)能夠有效地為皮膚組織提供營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。石蠟切片與蘇木精-伊紅（H&E）染色結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建的皮膚模型具有清晰的表皮和真皮結(jié)構(gòu)，且角質(zhì)形成細(xì)胞向真皮層的遷移極少（圖4）。

通過(guò)免疫染色，研究團(tuán)隊(duì)使用共聚焦顯微鏡確認(rèn)了皮膚模型的組織形態(tài)。表皮層中角蛋白10（CK10）的表達(dá)和基底層中角蛋白14（CK14）的表達(dá)驗(yàn)證了表皮層的均勻性和結(jié)構(gòu)完整性（圖5a）。此外，真皮層中的成纖維細(xì)胞形態(tài)以及I型和IV型膠原蛋白的表達(dá)也得到了清晰的展示（圖5b, c）。表皮層還觀察到了分化標(biāo)記物外皮蛋白（involucrin）和絲聚合蛋白(filaggrin)的表達(dá)（圖5d, e）。

圖4. 皮膚芯片中皮膚組織結(jié)構(gòu)及形成的示意圖。(a) 體內(nèi)皮膚結(jié)構(gòu)與芯片皮膚結(jié)構(gòu)的對(duì)比，角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞的位置以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、廢物和藥物的傳輸。右側(cè)為皮膚芯片組織切片的蘇木精-伊紅（H&E）染色圖像，比例尺：75微米；(b) 皮膚芯片中，從真皮形成到表皮形成的過(guò)程示意圖。

圖5. 免疫熒光圖像顯示皮膚構(gòu)建中表皮層和真皮層的存在。(a) 表皮層的橫截面，顯示角蛋白10和角蛋白14的表達(dá)；(b，c) 真皮層的底部視圖，顯示I型膠原蛋白和IV型膠原蛋白的表達(dá)；(d，e) 表皮層的橫截面，顯示外皮蛋白（involucrin）的表達(dá)和絲聚合蛋白（filaggrin）的表達(dá)，比例尺：75微米。

04

關(guān)鍵應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

皮膚芯片在藥物測(cè)試中的應(yīng)用

炎癥是最常見(jiàn)的皮膚疾病之一，影響約25%的人口。為測(cè)試皮膚芯片構(gòu)建炎癥模型并用于藥物檢測(cè)的有效性，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)使用促炎細(xì)胞因子TNF-α在芯片中誘導(dǎo)炎癥，并使用抗炎藥物地塞米松進(jìn)行治療。地塞米松作為FDA批準(zhǔn)的抗炎藥物，能夠有效緩解紅腫、發(fā)熱及疼痛。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了三種條件：對(duì)照組、炎癥組和炎癥+藥物組。對(duì)照組使用空白培養(yǎng)基；炎癥組于第二天加入TNF-α，24小時(shí)后更換為空白培養(yǎng)基；炎癥+藥物組于第二天加入TNF-α，24小時(shí)后更換為地塞米松。研究團(tuán)隊(duì)分別在各個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)收集上清液，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的表達(dá)。

為驗(yàn)證皮膚芯片的準(zhǔn)確藥物響應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)還與2D培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和人類(lèi)皮膚活檢樣本的藥物響應(yīng)情況進(jìn)行了對(duì)比。2D培養(yǎng)模型對(duì)炎癥和地塞米松的敏感性較高，在加入TNF-α后24小時(shí)內(nèi)炎癥急劇上升，TNF-α去除后炎癥立即下降，而地塞米松的加入更加顯著地降低了IL-6和IL-8的水平。相比之下，人類(lèi)皮膚活檢樣本的反應(yīng)較慢，TNF-α誘導(dǎo)24小時(shí)后炎癥水平上升幅度較小，而在第三天去除TNF-α并換成空白培養(yǎng)基后，炎癥組的炎癥水平卻持續(xù)上升；與此同時(shí)，炎癥+藥物組的炎癥水平在第三天加入地塞米松后得到了有效控制。通過(guò)對(duì)比，皮膚芯片與人類(lèi)皮膚活檢的藥物響應(yīng)結(jié)果相似，在TNF-α誘導(dǎo)的過(guò)程中顯示出了相對(duì)于2D 培養(yǎng)的延遲炎癥反應(yīng)，且在加入地塞米松后炎癥水平得到了有效控制（圖6）。

比較三種培養(yǎng)模型的整體趨勢(shì)，人類(lèi)皮膚活檢樣本與我們的皮膚芯片顯示了相似的炎癥和地塞米松治療模式，而2D培養(yǎng)模型則表現(xiàn)出更為劇烈的炎癥波動(dòng)，形成了顯著不同的藥物響應(yīng)趨勢(shì)。這表明，皮膚芯片模型能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)體內(nèi)反應(yīng)，從而提高藥物效力與安全性評(píng)估的可靠性。

圖6. 不同培養(yǎng)條件下的相對(duì)細(xì)胞因子水平變化。在3天的炎癥誘導(dǎo)和藥物處理后檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞因子水平：(a, b) 2D培養(yǎng)模型中的相對(duì)IL-6和IL-8水平變化；(c, d) 人類(lèi)皮膚活檢樣本中的相對(duì)IL-6和IL-8水平變化；(e, f) 皮膚芯片中的相對(duì)IL-6和IL-8水平變化；Control:對(duì)照組；TNF-α：僅炎癥組；TNF-α + Dex：炎癥+藥物組。

05

長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞穩(wěn)定性

實(shí)現(xiàn)靈活與高性能生產(chǎn)兼顧

皮膚活檢樣本在細(xì)胞活性和可培養(yǎng)時(shí)間上存在較大的批次差異。為評(píng)估長(zhǎng)期培養(yǎng)中的細(xì)胞活性，研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了皮膚芯片、2D培養(yǎng)及人類(lèi)皮膚活檢樣本上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的表達(dá)水平。LDH是檢測(cè)細(xì)胞損傷或死亡的關(guān)鍵指標(biāo)，LDH水平上升通常表明細(xì)胞活性下降或細(xì)胞受損。

在2D模型中，LDH水平在培養(yǎng)24小時(shí)后有所上升，48小時(shí)后略有下降。而人類(lèi)皮膚活檢樣本的LDH水平逐日遞增，培養(yǎng)48小時(shí)后幾乎達(dá)到初始水平的3倍之多。相比之下，皮膚芯片展示出了明顯的優(yōu)勢(shì)，其LDH水平在培養(yǎng)24小時(shí)后保持穩(wěn)定，并在培養(yǎng)48小時(shí)后顯著下降，顯示出較好的細(xì)胞穩(wěn)定性和長(zhǎng)期培養(yǎng)潛力（圖7），因此在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中更具適用性。

圖7. 在3天培養(yǎng)過(guò)程中，不同模型中乳酸脫氫酶（LDH）的表達(dá)水平變化。(a,b) 2D單層培養(yǎng)中LDH的表達(dá)水平變化；(c,d) 人類(lèi)皮膚活檢樣本中LDH的表達(dá)水平變化；(e,f) 皮膚芯片中的LDH的表達(dá)水平變化，LDH水平上升表明細(xì)胞活性下降或細(xì)胞受損。

06

發(fā)展與期望

摩方持續(xù)推動(dòng)終端應(yīng)用發(fā)展

本研究開(kāi)發(fā)的皮膚芯片結(jié)合了摩方精密的高精度3D打印技術(shù)與微流控系統(tǒng)，為藥物與化妝品篩選提供了一個(gè)高度準(zhǔn)確且具有生理相關(guān)性的體外模型。因此，該皮膚芯片通過(guò)與更多種類(lèi)的藥物和活性化合物相結(jié)合，有望為未來(lái)的生物醫(yī)藥和化妝品研究提供更多可能性。

總體而言，該皮膚芯片的開(kāi)發(fā)標(biāo)志著組織工程與藥物測(cè)試技術(shù)的重大進(jìn)展。通過(guò)提供一個(gè)更精準(zhǔn)且用戶友好的模型，使得摩方精密可以實(shí)現(xiàn)模擬人類(lèi)皮膚的真實(shí)反應(yīng)，并在皮膚科、藥理學(xué)及化妝品研究中展現(xiàn)出巨大潛力。未來(lái)的研究將進(jìn)一步整合更多類(lèi)型的細(xì)胞，如灌注免疫細(xì)胞，以提升模型的應(yīng)用性，并深入研究皮膚與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，這一進(jìn)展將有望為銀屑病、濕疹及過(guò)敏反應(yīng)等疾病的理解和治療提供新思路。